十二指肠瘘

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文献解读用于人体生理学建模的十二指肠肠芯 [复制链接]

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介绍

在之前的分享中,我们介绍过了肾芯片用于加速治疗开发的人类近端肾小管芯片,本期继续器官芯片的内容——十二指肠芯片。

人体内反应和疾病驱动机制的准确性和可预测性在体外很难评估。早期药物的开发和发现包含协助预测分析出量化潜在的治疗化合物,然后再进入临床。目前,监管机构要求的临床前试验分为两类:体内试验和体外试验。

体外研究包括测试吸收、分布、代谢和排泄(ADME)。用于测试吸收和肠道通透性的常规模型是在Transwell?插入物上进行单层培养的Caco-细胞系,用以模拟人类小肠。然而,缺乏相关的三维(3D)细胞结构,缺乏适当的细胞群比例,以及药物转运蛋白和药物代谢酶表达谱的改变,以上的障碍增加了人们对3D肠道类器官(或类肠)开发的兴趣。虽然类器官显示出作为临床前模型的前景,但它们缺乏已知影响体内组织功能的器官微环境的关键部分,包括微血管和机械力的存在,如流体流动和蠕动。另外,由于类器官存在于内部的顶膜上,这损失了进行准确的功能转运体研究的能力。

为了克服这些障碍,芯片上的器官技术可以用来重建包括肺、肠和肾在内的多个人体器官的复杂功能和病理生理学。在这里,我们设计了一种十二指肠-肠芯片,该芯片将类器官的强大细胞来源与器官芯片技术相结合,克服了类器官的实验局限性,使其更接近人类的转录组图谱。

主要亮点

?共培养模型包括类器官来源的原代上皮细胞和原代肠道微血管内皮细胞(HIMEC);

?流动和循环拉伸重新产生机械力,改善细胞形态和功能;

?肠道特异性微环境产生转录组学特征,与类器官相比,更接近体内条件;

?额外的潜在应用还包括评估转运体活性和CYP介质的代谢。

目标

开发一种十二指肠-肠芯片,通过正确的整合异种细胞群的比例和体内相关3D细胞,用以构筑和生理相关机械力,准确地再现体内生理学。

结果

十二指肠-肠芯片的开发始于将人十二指肠类器官培养物(从健康成年人的内镜活检中分离出的隐窝中建立)分离成碎片,然后将此细胞碎片种植在细胞外基质(ECM)涂层的多孔柔性聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜上的器官芯片上皮通道中(图1)。将原代人肠道微血管内皮细胞(HIMEC)接种在血管通道膜的另一侧。

当类器官培养物与膜达到融合时,用新鲜的细胞培养基持续灌注十二指肠-肠芯片。当细胞完全融合时,将细胞暴露于循环机械应变(10%应变,0.Hz)中,以模拟培养中肠蠕动的生理相关力。培养六天后,暴露于连续流动和周期性应变的细胞自发形成被认为是“绒毛样结构”的上皮波动,延伸到上皮通道的内腔,在体外重建体内细胞结构(图A)、细胞间相互作用和通透性参数。在细胞培养基流动(30μL/hr)下的原代肠上皮细胞,无论是否同时应用拉伸,均表现出极性良好的鹅卵石样形态,细胞高度增加(图B),连接处清晰,微绒毛密集(图C)。相反,静态条件下的培养导致扁平鳞状细胞形成单层,细胞间连接不明确。

图:液流-诱导原代肠上皮细胞高度和微绒毛形成增加;(a)细胞在静态条件或液流及+/-拉伸条件下培养7小时,免疫荧光(上图)和扫描电子显微镜(下图)显示的十二指肠类器官源性上皮细胞状态;(b)定量分析细胞平均高度;(c)每平方毫米微绒毛密度****p0.,数据代表平均值±SEM。

此外,在液体培养下,十二指肠-肠芯片模拟了天然人类肠道的多谱系分化。通过免疫染色细胞定量分析证实存在所有主要的分化肠上皮细胞类型(图3A、3C)。吸收性肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和Paneth细胞的比率类似在正常人十二指肠组织切片中观察到的细胞比率(图3B、3D)。

图3:十二指肠-肠芯片模拟了天然人类肠道的多谱系分化;(a,c)显示所有主要肠道细胞类型存在的荧光共焦显微照片;(b,d)表示液流培养第八天,十二指肠-肠芯片中不同肠上皮细胞类型的定量分析。

通过免疫荧光法评估分化细胞类型的基因表达,以确定十二指肠-肠芯片模拟人体组织。不同于类器官,转录组学分析显示,十二指肠-肠芯片和人体组织之间有个基因的共同子集(图4A)。对重叠基因的研究确定了与药物代谢和生物功能(包括消化、营养运输和解毒)相关的七条显著富集的途径(图4B),以此确认十二指肠-肠芯片的整体基因表达谱比类器官与成人十二指肠组织更为相似。

图4:转录组比较(a);差异基因表达分析,以确定十二指肠-肠芯片中上调或下调的基因,与类器官(蓝圈)(b)相比,发现了更丰富的生物过程。

为了证实融合的上皮和内皮单层细胞覆盖整个十二指肠-肠芯片,免疫荧光法评估分化细胞类型中药物转运蛋白的外排(MDR1、BCRP、MRP、MRP3)和摄取(PepT1、OATPB1、OCT1、IREG1)的基因表达(图5A)。管腔外排泵MDR1以及转运蛋白BCRP和摄取转运蛋白肽的转运蛋白1(PEPT1)位于生理相关位置(图5B和C)。活性MDR1外排泵的存在证明了该功能,通过在存在和不存在特定MDR1抑制剂长春花碱的情况下观察到罗丹明13的细胞内累积(图5D)。

图5:主要肠道药物转运蛋白和外排泵MDR1(P–gp);(a)药物外排和摄取相关基因表达水平的比较;(b)外排转运蛋白MDR1(绿色)和细胞表面标记物绒毛蛋白(洋红)的顶端定位;(c)外排泵蛋白的活性*p0.05,**p0.01,***p0.,****p0.。

结论

类有机物衍生的肠细胞可以与芯片技术上的器官相结合,制造出十二指肠肠芯片,该芯片显示出比Caco-或类器官更具生理相关性。该芯片是一个强大的临床前模型,模拟人体生理学,用于药物开发、深入了解疾病病因和研究肠道微生理学。

十二指肠-肠芯片也可以个性化,并通过使用单个患者的细胞生成芯片来评估患者之间药物处置和反应的个体差异。还可以了解遗传多态性对药代动力学和药效学的影响,以及影响吸收的各种因素的解耦效应。通过阐明驱动关键疾病表型的机制,使用该芯片有可能实现新的治疗方案开发。

综上所述,十二指肠-肠芯片提供了一个稳健的模型,促使更具预测性的临床前建模,并提高对健康和疾病状态下人类肠道组织基本生物学的理解。

结尾说明:

森格赛生物科技专注于单细胞组学、空间组学和类器官(包括器官芯片)相关前沿技术,致力为客户提供优质解决方案。
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